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iPSC培养的优化条件

2019-03-05 19:07:40

人胚胎干细胞(ESC)和人诱导多能干细胞(iPSC)能够无限增殖,并维持生成三个胚层的潜能,有望用来修复那些被疾病和创伤所破坏的各种各样的细胞和组织,从而成为目前研究的热点。 对于iPSC的培养来说,过去几年一直是采用ESC的培养条件,如TeSR培养基。尽管TeSR培养基能够在没有动物蛋白的情况下支持干细胞的生长,但其中添加了人血清白蛋白和人源基质蛋白,这就使得培养条件极其昂贵,不适合日常使用。因此,很多实验室还是在Matrigel上用BSA培养ESC和iPSC。 然而,因为来源问题,这些培养基成分可能会随批次而变化,那么在使用新批次之前必须进行大量的质量控制,而由于这些成分的批次差异,使用同一种培养基的不同实验室可能得到完全不同的结果。白蛋白的批次差异特别成问题,因此它在培养基中的浓度很高,而且它能与脂类及其他杂质结合。 针对这些问题,iPSC的创始人之一,美国威斯康辛大学麦迪逊分校的James Thomson教授领导的研究小组对iPSC的培养条件进行了优化,开发出一种完全限定的培养基E8。该成果近日发表在《Nature Methods》版上。 研究小组首先希望去除培养基中的白蛋白,但BSA的去除会导致细胞死亡。这表明BSA直接有助于细胞存活,或着BSA抵消了培养基中其他成分的毒性作用。实验结果表明,当BSA和BME同时去除后,ESC可以存活和增殖。 接下来,他们继续研究其他成分。胰岛素和FGF2对细胞存活和增殖很重要。维生素C促进了ESC增殖,而硒对细胞扩增很关键。他们还比较了12种不同的基础培养基,发现还是DMEM/F12。在添加了胰岛素、FGF2、维生素C和硒的DMEM/F12培养基(用NaHCO3调pH)中,研究人员能够扩增人ESC和iPSC,但在长期传代后偶尔有分化。因此,他们又添加了转铁蛋白和TGFβ(或Nodal),形成了终的E8培养基。这种培养基能够支持人ESC和iPSC的未分化增殖。 对于基质蛋白,目前也有很多选择,包括层粘连蛋白、玻璃粘连蛋白和纤维粘连蛋白,以及一些合成的表面。这些材料中的大部分都很昂贵,不适合大规模使用。由于玻璃粘连蛋白(vitronectin)相对比较容易过表达和纯化,于是研究人员检验了几种此蛋白的变异体,并发现其中两种(VTN-NC和VTN-N)能够支持人ESC的粘附和生长。在后续实验中,他们都使用VTN-NC。 使用E8这种新培养基以及玻璃粘连蛋白包被的表面,

iPSC培养的优化条件

研究人员证实了人iPSC的诱导效率改善。利用附加体方法,每106个初转染的成纤维细胞能生成个iPSC克隆。 由于E8培养基降低了费用且简化了质量控制,Thomson实验室目前使用它进行人ESC和iPSC的常规培养。这种简化的培养基也使得自我更新、细胞死亡和分化等通路研究有了更干净的背景,并支持显著改善的重编程效率。另外,由于E8是高度限定的,它还有利于人多能干细胞从基础研究到临床研究的转化。 来源:

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